Définition des critères de qualité applicables à la purification et à l’expansion de cellules souches mésenchymateuses en vue de leur utilisation en thérapie cellulaire hématopoïétique, immunosuppressive et régénérative

摘要

Les cellules souches mésenchymateuses (MSCs) résident dans le compartiment stromal de la moelle osseuse et représentent un type cellulaire versatile dont les propriétés pro-hématopoïétique, immunosuppressive et régénératrice restent mal caractérisées. Une caractérisation des préparations de MSCs a été effectuée à chaque passage dans les milieux d’expansion MSCGM et α-MEM + 20% FBS. Nous avons obtenu trois fois plus des cellules après cinq passages dans le MSCGM que dans l’ α-MEM + 20% FBS. Nous avons analysé le phénotype des MSCs après chaque passage par cytométrie en flux. A chaque passage et dans les deux milieux, les cellules sont négatives pour le CD45, fortement positives pour les antigènes CD73 et CD90 et faiblement positives pour les antigènes CD105 et CD106. Nous voulions évaluer la capacité des MSCs à se différencier en adipocytes, ostéoblastes et chondroblastes. A chaque passage testé et dans les deux milieux, les MSCs se sont différenciées dans ces trois tissus lorsqu’elles ont été placées dans des milieux de différenciation adéquats. Nous avons utilisé des RayBio® Human Cytokine Antibody Array pour analyser la présence de plusieurs cytokines dans le milieu conditionné par les MSCs. A chaque passage et dans les deux milieux, IL-6, IL-8 et VCAM-1 sont plus fortement exprimés que les autres cytokines. Nous avons utilisé le CFU-F assay pour évaluer la fréquence et la pureté des MSCs en culture. Nous avons observé que le nombre de CFU-F atteint un maximum au passage 3 et 4 après expansion dans le MSCGM et l’α-MEM + 20% FBS. Nous avons observé une plus grande proportion de CFU-F pour les cellules amplifiées dans le MSCGM comparé aux cellules amplifiées dans l’α-MEM + 20% FBS. Des cultures à long terme ont été effectuées pour analyser la capacité des MSCs à favoriser l’hématopoïèse in vitro. Nous avons observé une population plus importante de colonies hématopoïétiques lorsque les cultures à long terme sont effectuées avec des MSCs de 1er ou 2ème passages que lorsque les cultures sont effectuées avec des MSCs de 3ème, 4ème et 5ème passages. A des souris NOD/SCID, nous avons greffé des cellules CD34+ non cultivées ou le produit d’expansion des cellules CD34+ cultivées pendant une semaine avec des MSCs. Le chimérisme humain était présent dans chaque condition. Nous avons observé un chimérisme plus important quand les cellules CD34+ sont cultivées avec des MSCs du passage 4 par rapport aux passages antérieurs. Dans toutes les conditions, l’expression simultanée des antigènes CD19 ou CD33 sur les cellules humaines CD45+ démontre la présence de cellules repopulatrices avec un potentiel lympho-myéloïde. En conclusion, bien que les MSCs ont le même phénotype, le même potentiel de différenciation et le même profil sécrétoire à chaque passage et dans les deux milieux, les MSCs n’ont ni la même capacité à former des CFU-F, ni la même capacité à soutenir l’hématopoïèse in vitro ou in vivo.